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dc.contributor.authorFernandes, Joelma dos Santos-
dc.date.available2020-03-18-
dc.date.available2020-03-17T19:23:03Z-
dc.date.issued2014-02-15-
dc.identifier.urihttp://repositorioinstitucional.uea.edu.br//handle/riuea/2361-
dc.description.abstractFusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) is a filamentous fungus causal agent of Panama disease. The four pathogenic races of banana (R1, R2, TR4 and STR4) are capable of generating large socioeconomic losses to banana plantations sector in climates Tropical and Subtropical. In Brazil and abroad the banana crop shows economic growth and the spread of the disease contributes to the considerable reduction in the productivity of most banana cultivars. Information about which genes or components of metabolic pathways which act effectively in pathogenicity contribute to the development of various disease control strategies, such as breeding for resistance of the host, of inducing resistance to fungi by means of strains subjected to muting or silencing of gene-specific only reaches the pathogen, without prejudice to other beneficial microorganisms plant. Thus, this study aimed to obtain transformants through homologous recombination (knockout) and RNA interference (knockdown), and analyze them as the knockout and / or silencing of the gene encoding the transcription factor Sge1 in F. oxysporum f. sp. cubense. For this purpose, cassettes of different constructions were used for homologous recombination, one of the tape only had a checkmark concerning the hph gene and the other had the hph gene and the reporter gene GFP. For RNA interference, we used a tape with sense and antisense sequences of the SGE1 gene. Obtaining the transformants for analysis was possible in both methodologies "knockout and knockdown". But in the first part of the work was to analyze the occurrence of knockout did not identify any strain with homologous recombination in the target region (SGE1) because all transformants analyzed showed ectopic integration and transformants with cassette integration hph/gfp perfectly issued the green fluorescence. Taking into consideration the difficulties for the occurrence of homologous recombination, it is necessary observations in some ways. In the second part of this work we were isolated 120 transformants integration of the cassette for silencing via RNA interfência, in which only 13 were selected for analysis, and presented different morphological characteristics like radial size of the colonies, pigmentation and sporulation capacity, and Different relative expression levels observed before and after the mitotic stability test, of these, three (T2-30%; T4-27% e T7-47%) showed significant reduction in levels of relative expression of transcripts of the SGE1 gene indicating gene silencing. In the analysis of silencing by the pathogenicity test the selected transformants (T4 and T11), have achieved the rhizome and pseudostem of banana plants inoculated, but when compared to the wild type F. oxysporum cubense they managed to induce the symptoms of the disease in banana more slowly. Given these results, we can conclude that the RNAi mechanism is present and active in F. oxysporum cubense, proving to be an effective technique, opening new avenues for the development of mechanisms that block or reduce the pathogen action as well as functionally explore genomic data. Keywords: gene silencing, F. oxysporum f. sp. cubense, SGE1.pt_BR
dc.languageporpt_BR
dc.publisherUniversidade do Estado do Amazonaspt_BR
dc.rightsAcesso Abertopt_BR
dc.rightsAtribuição-NãoComercial-SemDerivados 3.0 Brasil*
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/*
dc.subjectSilenciamento gênicopt_BR
dc.subjectF. oxysporum f. sp. cubensept_BR
dc.subjectSGE1pt_BR
dc.titleSilenciamento do gene SGE1 por meio de recombinação homóloga e RNA de interferência em Fusarium oxysporum f. sp. cubensept_BR
dc.typeDissertaçãopt_BR
dc.date.accessioned2020-03-17T19:23:03Z-
dc.contributor.advisor-co1Silva, Gilvan Ferreira da-
dc.contributor.advisor1Santos, Joselita Maria Mendes dos-
dc.contributor.advisor1Latteshttp://lattes.cnpq.br/8745534872253902pt_BR
dc.contributor.referee1Santos, Joselita Maria Mendes dos-
dc.contributor.referee1Latteshttp://lattes.cnpq.br/8745534872253902pt_BR
dc.creator.Latteshttp://lattes.cnpq.br/8884118027809527pt_BR
dc.description.resumoO Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) é um fungo filamentoso agente causal do mal-doPanamá. As quatro raças patogênicas de bananeiras (R1, R2, TR4 e STR4) são capazes de gerar grandes prejuízos socioeconômicos ao setor da bananicultura nos países de clima Tropical e Subtropical. No Brasil e no exterior a bananicultura mostra crescimentos econômicos, e a disseminação da doença contribui para a redução considerável da produtividade da maioria das cultivares de bananeiras. Informações sobre quais genes ou componentes de rotas metabólicas que atuam efetivamente na patogenicidade contribuem para o desenvolvimento de várias estratégias de controle da doença, como melhoramento genético do hospedeiro visando à resistência, indução da resistência por meio de linhagens de fungos submetidas à silenciamento, ou silenciamento de gene-específico que atinja apenas o patógeno, sem prejuízo a outros micro-organismos benéficos a planta. Deste modo, o presente trabalho teve como objetivo obter transformantes por meio de recombinação homóloga (knockout) e RNA de interferência (knockdown), e analisá-los quanto ao knockout e/ou silenciamento do gene que codifica o fator de transcrição Sge1 em F. oxysporum f. sp. cubense. Para isso, foram utilizados cassetes com diferentes construções, para recombinação homóloga, um dos cassetes apresentava somente a marca de seleção referente ao gene hph e o outro apresentava o gene hph e o gene reporter gfp. Para o RNA de interferência foi utilizado um cassete com sequências senso e anti-senso do gene SGE1. A obtenção dos transformantes para análise foi possível nas duas metodologias “knockout e knockdown”. Porém na primeira parte do trabalho que foi a análise da ocorrência de knockout não foi identificada nenhuma linhagem com recombinação homóloga na região alvo (SGE1), pois todos os transformantes analisados apresentaram integração ectópica e os transformantes com integração do cassete hph/gfp emitiram perfeitamente a fluorescência verde. Levando em consideração as dificuldades para ocorrência de recombinação homóloga, são necessárias observações em alguns aspectos. Na segunda parte deste trabalho, foram isolados 120 transformantes com integração do cassete para silenciamento via RNA de interfência, no qual apenas 13 foram selecionados para análise, e apresentaram diferentes características morfológicas como, tamanho radial das colônias, pigmentação e capacidade de esporulação, além de diferentes níveis de expressão relativa verificados antes e depois do teste de estabilidade mitótica, dentre estes, três (T2-30%; T4-27% e T7-47%) apresentaram níveis significativos de redução da expressão relativa dos transcritos do gene SGE1, indicando o silenciamento do gene. Já na análise do silenciamento por meio do teste de patogenicidade os transformantes selecionados (T4 e T11), conseguiram atingir o rizoma e pseudocaule das bananeiras inoculadas, porém quando comparados à linhagem selvagem de Fusarium oxysporum cubense eles conseguiram induzir os sintomas da doença nas bananeiras mais lentamente. Diante destes resultados, pode-se concluir que o mecanismo de RNAi está presente e ativo em F. oxysporum cubense, demonstrando ser uma eficiente técnica, abrindo novos caminhos para o desenvolvimento de mecanismos que bloqueiem ou diminuam a ação do patógeno, bem como explorar funcionalmente dados genômico. Palavras chave: Silenciamento gênico, F. oxysporum f. sp. cubense, SGE1.pt_BR
dc.publisher.countryBrasilpt_BR
dc.publisher.programPrograma de Pós-Graduação em Biotecnologia e Recursos Naturaispt_BR
dc.relation.referencesCARIBÉ DOS SANTOS, A. C.; SENA, J. A. M.; SANTOS, S. C.; DIAS, C. V.; PIROVANI, C.; VALLE, R. R.; CASCARDO, J. C. M.; VINCENTZ, M. dsRNA-induced gene silencing in Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witches broom disease of cacao. Fungal Genetics and Biology. v.46, p. 825-836, 2009. 2. CARRERAS-VILLASEÑOR, N.; ESQUIVEL-NARANJO, E. U.; VILLALOBOSESCOBEDO, J. M.; ABREU-GOODGER, C.; HERRERA-ESTRELLA, A. The RNAi machinery regulates growth and development in the filamentous fungus Trichoderma atroviride. Mol Microbiol. v.89(1), p. 96-112. doi: 10.1111/mmi.12261, 2013. 3. COGONI, C.; MACINO, G. Homology-dependent gene silencing in plants and fungi: a number of variations on the same theme. Current Opinion in Microbiology. v.2, p.657– 662, 1999. 4. CONNOLLY, L. R.; SMITH, K. M.; FREITA, G. M.; The Fusarium graminearum Histone H3 K27 Methyltransferase KMT6 Regulates Development and Expression of Secondary Metabolite Gene Clusters. 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dc.subject.cnpqBiotecnologiapt_BR
dc.publisher.initialsUEApt_BR
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